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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶)

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶)_化学_自然科学_专业资料。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶,14.4-97KD) 1 电泳各试剂的配制 1.1 凝胶贮液:Acrylamide/Bis (30%T,2.67%C)——为聚丙烯酰胺 取丙烯酰胺 a

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶,14.4-97KD) 1 电泳各试剂的配制 1.1 凝胶贮液:Acrylamide/Bis (30%T,2.67%C)——为聚丙烯酰胺 取丙烯酰胺 acrylamide 29.2 g、双丙烯酰胺 N′N′-bis-methylene-acrylamide 0.8 g 至 100mL 量瓶中,加去离子水至刻度,摇匀,过滤。4℃避光储存。 1.2 即 10%的过硫酸铵 10%APS(临用现配) 称取过硫酸铵(ammonium persulfate)100 mg,加 1mL 去离子水溶解。 1.5M Tris-HCl,pH 8.8 称取 Tris base 18.15 g 于量瓶中,加去离子水 80mL,用 HCl 调节 pH 8.8,再加去离 子水至总体积 100mL。4℃储存。 0.5%(w/v)溴酚蓝:溴酚蓝 0.5g,去离子水定容至 100mL。 0.5M Tris-HCl,pH 6.8:称取 Tris (三羟甲基氨基甲烷)6 g 于量瓶中,加去离子水 60mL,用 HCl 调节 pH 6.8,再加去离子水至总体积 100mL。4℃储存。 10%(w/v)SDS:称取 10g SDS 至 100ml 量瓶中,加 90ml 去离子水,缓慢搅拌至溶 解,再加去离子水至刻度。 1.3 凝胶配制 按下表比例配制凝胶 水/mL 12%分离胶 5%浓缩胶 3.4 5.7 Acr/Bis(30%) /mL 4.0 1.7 1.5M Tris-HCl, 0.5M Tris-HCl, 10%SDS/mL pH 8.8/mL pH 6.8/mL 2.5 — — 2.5 0.1 0.1 分离胶及浓缩胶按上表比例配好后,均需脱气 15 min。临灌胶前,往分离胶中加入 100 μl 10%APS 及 10 μl TEMED;往浓缩胶中加入 100 μl 10%APS 及 20 μl TEMED(各试剂按比例 增减) 。 其中:TEMED 为催化剂 1.4 10×电极缓冲液,pH 8.3 称取 Tris base 30.3 g、Glycine(甘氨酸) 144 g、SDS 10.0 g 于 1000 mL 量瓶中,溶解, 加去离子水至刻度,不调 pH。4℃储存。临用前,取出放至室温,10 倍稀释,混匀,即为 电极缓冲液。 1.5 样品溶解液 S 去离子水 glycerol (甘油 ) 10% (w/v) SDS 0.5%(w/v)溴酚蓝 3.55mL; 2.5mL 2.0mL 0.2mL 0.5M Tris-HCl,pH 6.8 1.25mL; 总体积为 9.5 mL。室温储存。临用前加 50 μl β -巯基乙醇(β -Mercaptoethanol)于 950 μl 样品缓冲中,即为样品溶解液。 2 染色各试剂的配制 2.1 固定液:50%乙醇,12%冰醋酸,0.1%甲醛(即 250ml 无水乙醇+60ml 冰醋酸+0.5ml 甲 醛+去离子水至 500ml) 2.2 洗涤液:50%乙醇(500ml 无水乙醇+500ml 去离子水) 2.3 敏化液:0.02%无水硫代硫酸钠(62.78mg 五水硫代硫酸钠,加去离子水定容至 200ml) 2.4 染色液:0.5% 硝酸银,0.075%甲醛(临用现加) (0.5g 硝酸银+100ml 去离子水+197ul 甲醛)甲醛临用现加 2.5 显色液:6%无水碳酸钠,0.0004%硫代硫酸钠,0.05%甲醛(临用现加) (即 60g 无水碳 酸 钠 +6.28mg 五 水 硫 代 硫 酸 钠 + 去 离 子 水 至 1000ml 作 为 显 色 贮 备 液 , 每 次 用 时 取 100ml+132ul 甲醛即得) 2.6 终止液:50%乙醇,12%冰醋酸(250ml 无水乙醇+60ml 冰醋酸+去离子水至 500ml 即为 终止液) 以上均用去离子水配制。 3 针晶提取 3.1 取新鲜天南星科药材,去皮。 3.2 切碎至约 3 mm2。 3.3 将已切碎的药材置于大小适宜的洁净研钵中,加入 2 倍体积石油醚(60~90°)研磨, 每次约 5~10 min,反复多次。 3.4 将石油醚溶液倒出,经 4 层医用纱布过滤,合并滤液,用孔径 0.22 μm 的偏氟膜抽滤, 得滤饼。 3.5 取滤饼适量于离心管中, 加入 30 倍体积的四氯化碳, 混匀, 8000 rpm 离心 3min (三楼) , 去除四氯化碳液,反复 3 次。 3.6 离心后的下层沉淀中加入石油醚(60~90°)适量,混匀,用孔径 0.22 μm 的偏氟膜过 滤,得滤渣,即为毒针晶蛋白纯化的样品。 4 实验步骤 液, 使浓度为 30 μl/mg 混匀(,将各样品液及未预染标准蛋白于沸水浴中加热 5 min 后, 置于高速离心机中,10000 rpm 离心 3 min(五楼) 。 4.2 上样 精密吸取各样品液 10 μl、标准蛋白液 5 μl,按电泳仪使用说明中的上样方法上样。 4.3 电泳 设置电流强度为:浓缩胶 10 mA、分离胶 16 mA。 4.4 固定 将胶从玻璃板中取出,切角标记。放置适宜容器内,以固定液固定,平稳放置摇 床上,室温下固定 1 h 以上。 4.5 清洗 将固定液倾倒出,加入洗涤液,反复洗涤 3 次,每次 5 min。 4.6 敏化 将洗涤液倾倒出,加入敏化液,敏化 1min。 4.7 清洗 将敏化液倾倒出,加入去离子水,反复洗涤 3 次,每次 1 min。 4.8 染色 将去离子水倾倒出,加入染色液,避光染色 20 min。 4.9 清洗 将染色液倒出,加入去离子水,反复洗涤 3 次,每次 1 min。 4.10 显色 将去离子水倒出,加入显色液,先荡洗片刻后除去,再次加入显色液,注意观察, 至显示清晰条带即可停止显色。 4.11 终止显色 当胶上呈现出清晰地蛋白条带, 即将胶取出, 放入终止液中, 终止显色 10min。 4.12 保存 将终止显色的凝胶放入水中,保存。 4.13 凝胶摄像 在图像处理系统中将显色好的凝胶摄像。 4.1 样品制备 精密称取半夏及其它样品纯化毒针晶蛋白适量,分别以移液枪加入样品溶解

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